产品货号:
BTN131178
中文名称:
DNA Shuffling试剂盒
英文名称:
DNA Shuffling Kit
产品规格:
10T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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DNA Shuffling即DNA分子的体外同源重组,它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术。DNA Shuffling以一个或多个基因为起始材料,通过先随机将这些基因断裂成DNA短片段,再进行互为模板和引物的PCR(无外加引物),最后再进行常规PCR(外加引物)等处理,最后得到含有大量DNA重组突变的PCR产物。
- 即开即用,用户只需要提供样品DNA模板,无需单独准备各成分。
- 可以用于对长度在1000bp左右的同源片段进行DNA shuffling。
- 操作手册经过优化,只产生DNA Shuffling,而将点突变的几率减低到最低,节省大量优化时间。
组分 | 规格 |
DNase I溶液(1U/μL) | 10μL |
10×DNA Shuffling专用反应液A | 100μL |
10×DNA Shuffling专用反应液B | 100μL |
2×DNA Shuffling专用无引物PCR MasterMix | 1mL |
2×DNA Shuffling专用带引物PCR MasterMix | 1mL |
超纯水 | 1mL |
保存:-20℃,有效期1年。
待突变基因片段、DNA Shuffling引物(第二轮PCR引物)、胶回收试剂盒。
提前开启37℃和90℃水浴或金属浴。
一、待突变基因片段的制备
- 待突变基因片段可以用来源于多个物种的、含同源基因片段的DNA。这些基因片段可以来于PCR制备,也可以来于限制性内切酶酶切法制备。
- 这些含同源基因片段(或同源基因片段的一部分)的DNA片段总长度不要超过1kb,同时比DNA shuffling终产物(第二轮PCR产物)长200~400bp,因为第二轮PCR的引物位置在此步制备的模板DNA内侧100~200bp。
- 每次DNA Shuffling实验需要2~5μg起始DNA片段。如果使用几个同源基因片段,则其比例为1:1:1,总量保证有2~5μg。
- 起始模板DNA必须通过胶回收纯化,以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等。如果不去除此步的引物,其将对后续PCR造成严重干扰。
- 测OD260确定模板DNA浓度,此溶液为同源基因DNA模板,放冰上待用。
二、酶切和回收模板DNA
- 准备10μL DNase I工作液(0.1U/μL)。将1μL本试剂盒提供的1U/μL的DNase I溶液和8μL超纯水、1μL DNA Shuffling专用反应液A混合得浓度为0.1U/μL的DNase工作液,放冰上待用。此溶液必须现配现用。
- 在一个PCR管中,按顺序加入下列成分:
成分 用量 同源DNA片段(来于多个不同基因) 2~5μg 10×DNAShuffling专用反应液A 10μL 10×DNA Shuffling专用反应液B 10μL DNase I工作液(0.1U/μL) 1μL 超纯水 至100μL - 充分轻柔吹打混匀后37℃保温,分别5分钟、6分钟、7分钟和8分钟取样(可以根据实际情况适当调整酶切时间),每次取25μL到一个新的PCR管中,马上放75℃(10min)以灭活DNase I。
- 在2~3%琼脂糖凝胶或10% PAGE胶上电泳上步所得的4个样品(每个25μL),根据DNA电泳Marker锁定的分子量范围,回收25~150bp范围的DNA并将其溶解在超纯水中,测260nm得浓度,放冰上待用。
三、无引物PCR
- 在一干净PCR管中加入0.5μg回收片段、50μL DNA Shuffling专用无引物PCR MasterMix、补加超纯水到100μL。反应总体积为100μL。按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR:PCR前变性94℃ 150s,PCR循环40次(94℃ 30s,47.5℃ 45s,72℃ 10 s,每次循环后增加5s),最后72℃ 10分钟。
- PCR结束后,取5~10μL PCR产物进行电泳检测,然后对预期长度区域的PCR产物进行回收(如果同源区域长度为800bp,则回收600~1000bp范围的片段)。此步将去除小片段DNA对下轮PCR的干扰。
- 预留25%回收产物原液,剩余的75%分三份,每份25%。分别用超纯水将其分别稀释10倍、20倍和50倍。
四、带引物PCR
- 分别用上步的原液、10倍稀释液、20倍稀释液和50倍稀释液各1μL作为PCR模板,按下表设置4管带引物PCR反应:
成分 1号管 2号管 3号管 4号管 原液 1μL 10倍稀释液 1μL 20倍稀释液 1μL 50倍稀释液 1μL 自备F和R引物均10pmol/μL 各3μL 各3μL 各3μL 各3μL 加超纯水 至100μL 至100μL 至100μL 至100μL 2×DNA Shuffling专用带引物PCR MasterMix 50μL 50μL 50μL 50μL - 按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR:PCR前变性94℃ 150s,PCR循环25次(94℃ 30s,47.5℃ 45s,72℃ 60s,每次循环后增加5s),最后72℃ 10分钟。
- 电泳检测4个PCR产物,回收预期大小的PCR产物(根据引物位置估计预期大小),用于后续克隆和分析实验(略)。
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