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DNA Shuffling试剂盒图片
产品货号:
BTN131178
中文名称:
DNA Shuffling试剂盒
英文名称:
DNA Shuffling Kit
产品规格:
10T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

DNA Shuffling即DNA分子的体外同源重组,它是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)技术。DNA Shuffling以一个或多个基因为起始材料,通过先随机将这些基因断裂成DNA短片段,再进行互为模板和引物的PCR(无外加引物),最后再进行常规PCR(外加引物)等处理,最后得到含有大量DNA重组突变的PCR产物。




DNA Shuffling试剂盒


  • 即开即用,用户只需要提供样品DNA模板,无需单独准备各成分。
  • 可以用于对长度在1000bp左右的同源片段进行DNA shuffling。
  • 操作手册经过优化,只产生DNA Shuffling,而将点突变的几率减低到最低,节省大量优化时间。



组分规格
DNase I溶液(1U/μL)10μL
10×DNA Shuffling专用反应液A100μL
10×DNA Shuffling专用反应液B100μL
2×DNA Shuffling专用无引物PCR MasterMix1mL
2×DNA Shuffling专用带引物PCR MasterMix1mL
超纯水1mL

保存:-20℃,有效期1年。


待突变基因片段、DNA Shuffling引物(第二轮PCR引物)、胶回收试剂盒。


提前开启37℃和90℃水浴或金属浴。


一、待突变基因片段的制备
  1. 待突变基因片段可以用来源于多个物种的、含同源基因片段的DNA。这些基因片段可以来于PCR制备,也可以来于限制性内切酶酶切法制备。
  2. 这些含同源基因片段(或同源基因片段的一部分)的DNA片段总长度不要超过1kb,同时比DNA shuffling终产物(第二轮PCR产物)长200~400bp,因为第二轮PCR的引物位置在此步制备的模板DNA内侧100~200bp。
  3. 每次DNA Shuffling实验需要2~5μg起始DNA片段。如果使用几个同源基因片段,则其比例为1:1:1,总量保证有2~5μg。
  4. 起始模板DNA必须通过胶回收纯化,以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等。如果不去除此步的引物,其将对后续PCR造成严重干扰。
  5. 测OD260确定模板DNA浓度,此溶液为同源基因DNA模板,放冰上待用。


二、酶切和回收模板DNA
  1. 准备10μL DNase I工作液(0.1U/μL)。将1μL本试剂盒提供的1U/μL的DNase I溶液和8μL超纯水、1μL DNA Shuffling专用反应液A混合得浓度为0.1U/μL的DNase工作液,放冰上待用。此溶液必须现配现用。
  2. 在一个PCR管中,按顺序加入下列成分:
    成分用量
    同源DNA片段(来于多个不同基因)2~5μg
    10×DNAShuffling专用反应液A10μL
    10×DNA Shuffling专用反应液B10μL
    DNase I工作液(0.1U/μL)1μL
    超纯水至100μL

  3. 充分轻柔吹打混匀后37℃保温,分别5分钟、6分钟、7分钟和8分钟取样(可以根据实际情况适当调整酶切时间),每次取25μL到一个新的PCR管中,马上放75℃(10min)以灭活DNase I。
  4. 在2~3%琼脂糖凝胶或10% PAGE胶上电泳上步所得的4个样品(每个25μL),根据DNA电泳Marker锁定的分子量范围,回收25~150bp范围的DNA并将其溶解在超纯水中,测260nm得浓度,放冰上待用。


三、无引物PCR
  1. 在一干净PCR管中加入0.5μg回收片段、50μL DNA Shuffling专用无引物PCR MasterMix、补加超纯水到100μL。反应总体积为100μL。按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR:PCR前变性94℃ 150s,PCR循环40次(94℃ 30s,47.5℃ 45s,72℃ 10 s,每次循环后增加5s),最后72℃ 10分钟。
  2. PCR结束后,取5~10μL PCR产物进行电泳检测,然后对预期长度区域的PCR产物进行回收(如果同源区域长度为800bp,则回收600~1000bp范围的片段)。此步将去除小片段DNA对下轮PCR的干扰。
  3. 预留25%回收产物原液,剩余的75%分三份,每份25%。分别用超纯水将其分别稀释10倍、20倍和50倍。


四、带引物PCR
  1. 分别用上步的原液、10倍稀释液、20倍稀释液和50倍稀释液各1μL作为PCR模板,按下表设置4管带引物PCR反应:
    成分1号管2号管3号管4号管
    原液1μL
    10倍稀释液1μL
    20倍稀释液1μL
    50倍稀释液1μL
    自备F和R引物均10pmol/μL各3μL各3μL各3μL各3μL
    加超纯水至100μL至100μL至100μL至100μL
    2×DNA Shuffling专用带引物PCR MasterMix50μL50μL50μL50μL

  2. 按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR:PCR前变性94℃ 150s,PCR循环25次(94℃ 30s,47.5℃ 45s,72℃ 60s,每次循环后增加5s),最后72℃ 10分钟。
  3. 电泳检测4个PCR产物,回收预期大小的PCR产物(根据引物位置估计预期大小),用于后续克隆和分析实验(略)。

相关搜索:DNA Shuffling试剂盒DNA体外同源重组DNA洗牌DNA Shuffling Kit
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