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DNA Shuffling即DNA分子的体外同源重组，它是一种分子水平上的定向进化(directed技术。DNA Shuffling以一个或多个基因为起始材料，通过先随机将这些基因断裂成D NA短片段，再进行互为模板和引物的PCR （无外加引物），最后再进行常规PCR （外加引物）等处理，最后得到含有大量DNA重组突变的PCR产物。

• 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板，无需单独准备各成分。
  
• 可以用于对长度在1000bp左右的同源片段进行DNA shuffling。
  
• 操作手册经过优化，只产生DNA Shuffling，而将点突变的几率减低到最低节省大量优化时间。
  
• 本制品足够10次DNA Shuffling反应。
  
• 本制品只适用于科研，不能用于临床。

1. 待突变基因片段可以用来源于多个物种的、含同源基因片段的DNA。这些基因片段可以来于PCR制备，也可以来于限制性内切酶酶切法制备。
   
2. 这些含同源基因片段（或同源基因片段的一部分）的DNA片段总长度不要超过1kb，同时比DNA shuffling终产物（第二轮PCR产物）长200～400bp，因为第二轮PCR的引物位置在此步制备的模板DNA内侧100～200bp。
   
3. 每次DNA Shuffling实验需要2～5μg起始DNA片段。如果使用几个同源基因片段，则其比例为1:1:1，总量保证有2～5μg。
   
4. 起始模板DNA必须通过胶回收纯化，以便彻底去除残留的质粒模板、引物和非特异扩增产物等。如果不去除此步的引物，其将对后续PCR造成严重干扰。
   
5. 测OD260确定模板DNA浓度，此溶液为同源基因DNA模板，放冰上待用。

1. 准备10μL DNase I工作液(0.1U/μL)。将1μL本试剂盒提供的1U/μL的DNase I溶液和8μL超纯水、1μL DNA Shuffling专用反应液A混合得浓度为0.1U/μL的DNase工作液，放冰上待用。此溶液必须现配现用。
   
2. 在一个PCR管中，按顺序加入下列成分：
   

   成分	用量
   同源DNA片段(来于多个不同基因)	2～5μg
   10×DNAShuffling专用反应液A	10μL
   10×DNA Shuffling专用反应液B	10μL
   DNase I工作液(0.1U/μL)	2μL
   超纯水	到100μ L

   
   
3. 充分轻柔吹打混匀后37℃保温，分别在2分钟、4分钟、6分钟和8分钟取样，每次取25μL到一个新的PCR管中，马上放75℃以灭活DNase I。
   
4. 在2～3%琼脂糖凝胶或10% PAGE胶上电泳上步所得的4个样品(每个25μL)，根据DNA电泳Marker锁定的分子量范围，回收25～150bp范围的DNA并将其溶解在超纯水中，测260nm得浓度，放冰上待用。

1. 在一干净PCR管中加入0.5μg回收片段、50μL DNA Shuffling专用无引物PCR MasterMix、补加超纯水到100μL。反应总体积为100μL。按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR：PCR前变性94℃150秒，PCR循环40次（94℃ 30s，47.5℃ 45s，72℃ 10 s，每次循环后增加5s），最后72℃ 10分钟。
   
2. PCR结束后，取5～10μL PCR产物进行电泳检测，然后对预期长度区域的PCR产物进行回收（如果同源区域长度为800bp，则回收600～1000bp范围的片段）。此步将去除小片段DNA对下轮PCR的干扰。
   
3. 预留25%回收产物原液，剩余的75%分三份，每份25%。分别用超纯水将其分别稀释10倍、20倍和50倍。

1. 分别用上步的原液、10倍稀释液、20倍稀释液和50倍稀释液各1μL作为PCR模板，按下表设置4管带引物PCR反应：
   

   成分	1号管	2号管	3号管	4号管
   原液	1μL
   10倍稀释液		1μL
   20倍稀释液			1μL
   50倍稀释液				1μL
   自备F和R引物均10pmol/μL	各3μL	各3μL	各3μL	各3μL
   加超纯水	至100μL	至100μL	至100μL	至100μL
   2×DNA Shuffling专用带引物PCR MasterMix	50μL	50μL	50μL	50μL

   
   
2. 按下面的PCR反应参数进行第一轮无引物PCR：PCR前变性94℃150秒，PCR循环25次（94℃ 30s，47.5℃ 45s，72℃ 60 s，每次循环后增加5s），最后72℃ 10分钟。
   
3. 电泳检测4个PCR产物，回收预期大小的PCR产物（根据引物位置估计预期大小），用于后续克隆和分析实验（略）。